High-performance liquid chromatography: verschil tussen versies

geen bewerkingssamenvatting
k
 
== Principe ==
Het monster wordt geïnjecteerd met een [[HPLC-injector|injector]]. Deze injector is een soort kraan met een ''loop'' eraan, een lus met een nauwkeurig bekend [[inhoud|volume]] (gewoonlijk 5[[Liter|μl]]-5mL). Met een injectiespuit vult men deze loop, waarna de stand van de kraan wordt gedraaid, zodat het [[monster (chemie)|monster]] in het systeem wordt geïnjecteerd. Hierna mengtgaat het zichmonster mee met de loopvloeistof, de ''mobiele fase'', meestaldoor eende mengsel van polaire oplosmiddelen [[water]], [[methanol]] en/of [[acetonitril]]kolom. Door de relatief hoge snelheid van de loopvloeistofmobiele (eluens),fase vindt er nauwelijks diffusie plaats van het monster in de oplosmiddelen. Het mengsel gaat vervolgens door een kolom heen, onder hoge druk. Vaak wordt gedurende de scheiding de samenstelling van de loopvloeistof langzaam veranderd ([[gradiënt (scheikunde)|gradiënt]]) om alle componenten van het monster door de kolom te leiden. Immers, deeltjes die in het ene oplosmiddel liever aan de kolom blijven plakken (dus slechter oplosbaar zijn in dat oplosmiddel), kunnen in het andere oplosmiddel wel van de kolom komen (dus beter oplosbaar zijn in dát oplosmiddel). Door te spelen met deze gradiënt-verhoudingen kunnen verschillende componenten van elkaar gescheiden worden.
 
De snelheid waarmee de componenten van het monster de kolom passeren kan beïnvloed worden door een modifier die de elutie versneld toe te voegen aan de mobiele fase. Het percentage modifier kan gedurende de hele analyse gelijk blijven (isocratische chromatografie) of gedurende de analyse oplopen ([[gradiënt (scheikunde)|gradiënt]]).
 
De toegepaste modifier is afhankelijk van het type chromatografie.
{| class="wikitable"
! Type chromatografie
! Veelgebruikte basiseluensen
! Veelgebruikte modifiers
|-
| '''Reversed phase chromatografie''' || Water, eventueel met bufferzouten en/of andere hulpstoffen || Methanol, acetonitril
|-
| '''Normal phase chromatografie''' || Hexaan (of vergelijkbare alkanen), methanol, acetonitril || Water, methanol, acetonitril
|-
| '''Ion-Exchange chromatografie''' || Oplossingen van natriumhydroxide, natriumcarbonaat en andere zouten || Oplossingen van natriumacetaat, natriumwaterstofcarbonaat en andere zouten
|-
|}
 
Andere factoren die van belang zijn bij de scheiding zijn: samenstelling van het eluens ([[pH]], toevoeging van hulpstoffen), kolomtype, doorstroomsnelheid (flow), lengte van de leidingen.
 
De binnenkant van de kolom, de ''stationaire fase'', is gevuld met een pakking van kleine bolletjes. Deze pakking is meestal van silica, maar andere materialen komen ook voor. De grootte van de bolletjes is afhankelijk van het type kolom, maar diameters tussen 3 μm en 10 μm zijn het meest gebruikelijk. Kleinere deeltjes geven een betere scheiding dan grotere deeltjes, maar ook een hogere druk. De consequentie daarvan is dat er bij een kolom met grote deeltjes meer ruimte is om de flow te variëren. De bolletjes zijn 'bekleed' (chemisch gebonden) met een actieve laag die een interactie aangaat met de [[mobiele fase]] en de componenten van het te analyseren monster.
 
=== Normal Phase chromatografie ===
Bij Normal Phase HPLC is de pakking van de kolom polair en de mobiele fase apolair. Daardoor hebben polaire componenten een sterkere interactie met de stationaire fase dan apolaire componenten. Apolaire componenten komen dus sneller van de kolom af dan polaire componenten. Vanwege het hoge verbruik van organische oplosmiddelen wordt Normal Phase HPLC nog maar weinig toegepast, voor de meeste toepassingen bestaat een milieuvriendelijker Reversed Phase alternatief.
 
HILIC is een variant op Normal Phase HPLC. Bij NPLC wordt als mobiele fase een apolair oplosmiddel gebruikt. Dit brengt het probleem met zich mee dat sommige stoffen zo hydrofiel zijn dat ze niet meer van de kolom afkomen. Door minder dan 20% water toe te voegen aan het eluens kan er echter voor gezorgd worden dat ook deze stoffen van de kolom afkomen. Door de competitie van het water en de stoffen voor binding aan de kolom, worden alle stoffen uiteindelijk van de kolom verdreven door het water en komen dus in volgorde van toenemende polariteit van de kolom af. Het toevoegen van water kan zowel isocratisch als met een gradiënt gebeuren.
 
=== Reversed Phase chromatografie===
Bij Reversed Phase HPLC is de polariteit omgekeerd ten opzichte van Normal Phase HPLC; de pakking van de kolom is apolair en de mobiele fase is polair. Het gevolg daarvan is dat de volgorde van elutie van de verschillende componenten ook omgekeerd is ten opzichte van Normal Phase HPLC: polaire componenten komen sneller van de kolom af dan apolaire componenten.
 
 
==== Spectrofotometrie ====
 
[[spectrofotometrie|Spectrofotometrische detectoren]] zijn selectieve detectoren, wat inhoudt dat de spectrofotometrische detector selectief stoffen kan detecteren, door het aanpassen van de golflengte waarmee gedetecteerd wordt.
 
Bij spectofotometrie zijn er twee verschillende detectie mogelijkheden: [[monochroom|monochromatische]] detectie en [[polychroom|polychromatische]] detectie. Monochromatische detectie houdt in, dat er bij een kleine bandbreedte van het spectrum, de absorptie wordt gemeten. Van het licht worden hier de ongewenste golflengte weg gefilterd, waardoor alleen de gewenste golflengtes door het monster gaan. Polychromatische detectoren kunnen tijdens de meting de golflengte veranderen en zo een groot golflengtegebied in korte tijd langs gaan, of meerdere golflengtes simultaan meten, zodat de absorptie van het monster gemeten kan worden bij verschillende golflengtes of een groot gebied van golflengtes op te vangen zonder dat de circulatie in de kolom te onderbreken. De [[UV/VIS-spectroscopie#Golflengteselectie met een Photo Diode Array detector|Diode Array Detector]] (DAD) behoort tot de polychromatische detectors. Deze detector geeft spectrale informatie, waar gescheiden componenten herkend kunnen worden.
 
==== Fluorescentie DetectorFluorescentiedetector ====
 
[[Bestand:Overzicht flow cel fluorescentie.png|thumb|Schematisch overzicht van een flow cel in een fluorescentie detector]]
[[Fluorescentie]] detectoren worden voornamelijk bij vloeistof chromatografie gebruikt en detecteren alleen fluorescente stoffen. Ongeveer 10 % van de organische samenstellingen zijn fluorescent. Fluorescente stoffen hebben de capaciteit om een deel van het licht dat uitgezonden wordt door de lichtbron te absorberen en gedeeltelijk terug te zenden met een andere golflengte. De intensiteit van fluorescente stoffen zijn evenredig met de concentratie van de [[analyt]], zolang de concentratie van de analyt laag wordt gehouden. De fluorescentie detectoren zijn erg gevoelig en worden daarom vaak gebruikt bij het analyseren van [[spoor (afdruk)|sporen]]. Jammer genoeg is de reactie slechts lineair over een relatief beperkt concentratiegebied van twee ordes van grootte.
Het meetdomein van de fluorescentie detector, in hoeverre de detector stoffen kan detecteren, kan uitgebreid worden door het gebruik van een derivatiseringstechniek. Deze derivatiseringstechniek houdt in dat stoffen ofwel voordat ze in de kolom gaan of als ze net uit de kolom komen worden gemodificeerd tot afgeleiden (of [[derivaat (chemie)|derivaten]]), waardoor ze beter zijn te detecteren. Er zijn een aantal reagentia die specifiek ontwikkeld zijn om fluorescente derivaten te synthetiseren. Voor deze methode wordt een automatische reagensautomaat of voorafgaand aan de kolom of tussen de kolom en detector geplaatst. Dit wordt gedaan om het monster 1 of meerdere reacties te laten ondergaan en deze fluorescent te maken voor of nadat het monster is geïnjecteerd.
 
==== Refractie-Index DetectorBrekingsindexdetector ====
 
[[Bestand:Schema RI detector.png|thumb|Schematisch overzicht van een RI detector]]
De Refractie-Index detector (RI detector) is gebaseerd op het principe van de [[brekingsindex|refractie-index]] (brekingsindex). De detector bestaat schematisch uit twee compartimenten, waarvan één is gevuld met pure mobiele fase en één met de mobiele fase, die van de kolom af [[eluens|elueert]]. In de praktijk gebeurt het vaak dat de [[optica|optische eigenschappen]] van deze media verschillen, en vaak komen deze fases slechts bij één golflengte overeen. Het uitgezonden licht is daarom praktisch altijd monochromatisch. Wanneer er een stof uit de kolom elueert verandert deze stof de optische eigenschappen van de mobiele fase, waardoor ook de refractie-index verandert. Deze verandering van de refractie-index wordt gevisualiseerd in de vorm van een verandering van de hoek van de uitgezonden lichtstraal. Door middel van terugkoppeling kan deze verandering geregistreerd worden en uitgezet. De detector registreert zowel positieve als negatieve pieken, waardoor de nullijn van de grafiek in het midden is uitgezet.
5.128

bewerkingen