High-performance liquid chromatography: verschil tussen versies

→‎Detectiemethoden: apart artikel aangemaakt voor detectoren, dit artikel begon wat erg lang te worden
(→‎Detectiemethoden: apart artikel aangemaakt voor detectoren, dit artikel begon wat erg lang te worden)
 
== Detectiemethoden ==
{{Hoofdartikel|Detector (chromatografie)}}
 
De [[chromatografie]] is belangrijk om de compositie van het monster te bepalen, maar om de concentratie van het monster te bepalen is er een bepaalde [[Detector (chromatografie)|detector]] nodig. Er zijn verschillenden detectoren voor HPLC. ZoEnkele veelgebruikte zijn er onder andere de spectrofotometrie detector, de fluorescentie detector en Refractie-index detector( RI detector).volgende:
 
==== *[[Spectrofotometrie]]: Meet de absorptie van licht bij een specifieke ====golflengte
*[[Fluorescentie|Fluorescentiedetector]]: meet fluorescentie (emissie van licht door aangeslagen moleculen)
[[spectrofotometrie|Spectrofotometrische detectoren]] zijn selectieve detectoren, wat inhoudt dat de spectrofotometrische detector selectief stoffen kan detecteren, door het aanpassen van de golflengte waarmee gedetecteerd wordt.
*[[Brekingsindex]]detector
 
==== *[[Evaporative Light Scattering Detector]] ====(ELSD)
Deze detectiemethode is gebaseerd op de [[wet van Lambert-Beer]] (A = ɛ ℓ C). De [[absorptie]] A van de [[mobiele fase]] wordt aan het einde van de [[kolom (chemie)|kolom]] gemeten, bij 1 of meerdere [[golflengte]]s. De absorptie is de lichtintensiteit die de mobiele fase in wordt gestuurd minus de lichtintensiteit die er vervolgens weer uit komt. Deze intensiteit is afhankelijk van de [[molaire absorptie coëfficiënt]] : ɛ. Het is essentieel dat de mobiele fase bij de relevante golflengte [[transparantie (optiek)|transparant]] is of een lage concentratie heeft. Indien dit niet het geval is zal de absorptie zodanig groot worden, dat er geen of te weinig licht meer uit het monster komt.
 
Wanneer de absorptie A, de extinctie coefficiënt ɛ en de lengte van het [[cuvet]] ℓ bekend zijn kunnen deze waardes ingevuld worden in de wet van Lambert-Beer. Op deze manier kan de concentratie van het monster berekend worden.
 
Bij spectofotometrie zijn er twee verschillende detectie mogelijkheden: [[monochroom|monochromatische]] detectie en [[polychroom|polychromatische]] detectie. Monochromatische detectie houdt in, dat er bij een kleine bandbreedte van het spectrum, de absorptie wordt gemeten. Van het licht worden hier de ongewenste golflengte weg gefilterd, waardoor alleen de gewenste golflengtes door het monster gaan. Polychromatische detectoren kunnen tijdens de meting de golflengte veranderen en zo een groot golflengtegebied in korte tijd langs gaan, of meerdere golflengtes simultaan meten, zodat de absorptie van het monster gemeten kan worden bij verschillende golflengtes of een groot gebied van golflengtes op te vangen zonder dat de circulatie in de kolom te onderbreken. De [[UV/VIS-spectroscopie#Golflengteselectie met een Photo Diode Array detector|Diode Array Detector]] (DAD) behoort tot de polychromatische detectors. Deze detector geeft spectrale informatie, waar gescheiden componenten herkend kunnen worden.
 
==== Fluorescentiedetector ====
[[Bestand:Overzicht flow cel fluorescentie.png|thumb|Schematisch overzicht van een flow cel in een fluorescentie detector]]
[[Fluorescentie]] detectoren worden voornamelijk bij vloeistof chromatografie gebruikt en detecteren alleen fluorescente stoffen. Ongeveer 10 % van de organische samenstellingen zijn fluorescent. Fluorescente stoffen hebben de capaciteit om een deel van het licht dat uitgezonden wordt door de lichtbron te absorberen en gedeeltelijk terug te zenden met een andere golflengte. De intensiteit van fluorescente stoffen zijn evenredig met de concentratie van de [[analyt]], zolang de concentratie van de analyt laag wordt gehouden. De fluorescentie detectoren zijn erg gevoelig en worden daarom vaak gebruikt bij het analyseren van [[spoor (afdruk)|sporen]]. Jammer genoeg is de reactie slechts lineair over een relatief beperkt concentratiegebied van twee ordes van grootte.
 
Een flow cel wordt gebruikt als sensor waar het [[excitatie (kwantummechanica)|exciterende]] licht [[axiaal]] doorheen gaat. Een [[fotocel]] zit gevestigd aan de kant van de cel om het uitgezonden licht op te vangen. De celwand wordt vaak gemaakt van [[Pyrex]] glas om te verhinderen dat het exciterende licht ( meestal UV-licht) de fotocel bereikt. Wanneer het fluorescente monster in de cel zit absorbeert deze het exciterende licht en zendt dit in een andere golflengte weer uit. Het geëmitteerde licht de celwand en wordt ontvangen door de fotocel. De intensiteit van het licht wordt door een computer geregistreerd. Het exciterende licht kan bij 254 nm UV door een [[kwiklamp]] veroorzaakt worden of het licht kan van een [[deuteriumlamp]] zijn dat bij elke golflengte geproduceerd kan worden door een [[monochromator]].
 
Het meetdomein van de fluorescentie detector, in hoeverre de detector stoffen kan detecteren, kan uitgebreid worden door het gebruik van een derivatiseringstechniek. Deze derivatiseringstechniek houdt in dat stoffen ofwel voordat ze in de kolom gaan of als ze net uit de kolom komen worden gemodificeerd tot afgeleiden (of [[derivaat (chemie)|derivaten]]), waardoor ze beter zijn te detecteren. Er zijn een aantal reagentia die specifiek ontwikkeld zijn om fluorescente derivaten te synthetiseren. Voor deze methode wordt een automatische reagensautomaat of voorafgaand aan de kolom of tussen de kolom en detector geplaatst. Dit wordt gedaan om het monster 1 of meerdere reacties te laten ondergaan en deze fluorescent te maken voor of nadat het monster is geïnjecteerd.
 
==== Brekingsindexdetector ====
[[Bestand:Schema RI detector.png|thumb|Schematisch overzicht van een RI detector]]
De Refractie-Index detector (RI detector) is gebaseerd op het principe van de [[brekingsindex|refractie-index]] (brekingsindex). De detector bestaat schematisch uit twee compartimenten, waarvan één is gevuld met pure mobiele fase en één met de mobiele fase, die van de kolom af [[eluens|elueert]]. In de praktijk gebeurt het vaak dat de [[optica|optische eigenschappen]] van deze media verschillen, en vaak komen deze fases slechts bij één golflengte overeen. Het uitgezonden licht is daarom praktisch altijd monochromatisch. Wanneer er een stof uit de kolom elueert verandert deze stof de optische eigenschappen van de mobiele fase, waardoor ook de refractie-index verandert. Deze verandering van de refractie-index wordt gevisualiseerd in de vorm van een verandering van de hoek van de uitgezonden lichtstraal. Door middel van terugkoppeling kan deze verandering geregistreerd worden en uitgezet. De detector registreert zowel positieve als negatieve pieken, waardoor de nullijn van de grafiek in het midden is uitgezet.
 
[[Bestand:Overzicht flow cel.png|thumb|Schematisch overzicht van een flow cel in een RI detector]]
De RI detector is een van de minst gevoelige LC detectoren. Dit komt doordat het zeer gevoelig is voor veranderingen in temperatuur, druk en flow rate. Als een gevolg hiervan, moet de temperatuur van de detector met uiterste precisie worden gereguleerd (tot het punt van 0,001◦C, evenals de temperatuur in de kolom. Ook is het niet mogelijk om een RI detector te gebruiken bij een HPLC met een [[Concentratiegradiënt|gradiënt]]. In het geval dat de mobiele fase niet isocratisch is zal de mobiele fase uit de kolom steeds meer afwijken van de pure mobiele fase. Hierdoor zal de refractie-index veranderen en de grafiek een piek weergeven, terwijl dit niet komt door een analyt. De RI detector wordt vaak gebruikt in combinatie met andere detectoren.
Ondanks deze nadelen wordt de RI detector vaak gebruikt. Dit komt doordat de detector ideaal is voor het detecteren van niet-ionische stoffen, die geen UV-straling absorberen en niet fluoresceren. Stoffen die het beste te detecteren zijn met de RI-detector zijn [[vetzuur|vetzuren]], [[alcohol (stofklasse)|alcoholen]], [[Koolhydraat|suikers]] etc.)
 
==== Evaporative Light Scattering Detector ====
In een ELSD-detector wordt de mobiele fase die van de kolom af komt continu verneveld. Deze nevel wordt beschenen met een lichtbron. De druppeltjes waar de nevel uit bestaat weerkaatsen een deel van het licht, en de intensiteit van dat weerkaatste licht wordt gemeten met een lichtgevoelige cel. Op het moment dat er een component van de kolom af komt verandert de gemiddelde grootte van de druppeltjes, waardoor ook intensiteit van het weerkaatste licht verandert. Deze verandering in intensiteit wordt geregistreerd door de lichtgevoelige cel en resulteert in een piek in het chromatogram.
 
Het voordeel van een ELSD-detector is dat er een zeer breed scala aan componenten mee gemeten kunnen worden; stoffen die op geen enkele manier optisch actief zijn (en dus niet gedetecteerd kunnen worden met een spectrofotometer, fluorescentiedetector of brekingsindexdetector) kunnen vaak wel gedetecteerd worden met een ELSD-detector. Het nadeel van een ELSD-detector is dat de signaal-ruisverhouding vaak minder gunstig is dan bij de eerder genoemde detectoren.
 
==Kolomeigenschappen==
5.128

bewerkingen