High-performance liquid chromatography: verschil tussen versies

 

== Principe ==

Het monster wordt geïnjecteerd met een [[HPLC-injector|injector]]. Deze injector is een soort kraan met een ''loop'' eraan, een lus met een nauwkeurig bekend [[inhoud|volume]] (gewoonlijk 5[[Liter|μl]]-5mL). Met een injectiespuit vult men deze loop, waarna de stand van de kraan wordt gedraaid, zodat het [[monster (chemie)|monster]] in het systeem wordt geïnjecteerd. Hierna mengt het zich met de loopvloeistof, de ''mobiele fase'', meestal een mengsel van polaire oplosmiddelen [[water]], [[methanol]] en/of [[acetonitril]]. Door de relatief hoge snelheid van de loopvloeistof (eluens), vindt er nauwelijks diffusie plaats van het monster in de oplosmiddelen. Het mengsel gaat vervolgens door een kolom heen, onder hoge druk. Vaak wordt gedurende de scheiding de samenstelling van de loopvloeistof langzaam veranderd ([[gradiënt (scheikunde)|gradiënt]]) om alle componenten van het monster door de kolom te leiden. Immers, deeltjes die in het ene oplosmiddel liever aan de kolom blijven plakken (dus slechter oplosbaar zijn in dat oplosmiddel), kunnen in het andere oplosmiddel wel van de kolom komen (dus beter oplosbaar zijn in dát oplosmiddel). Door te spelen met deze gradiënt-verhoudingen kunnen verschillende componenten van elkaar gescheiden worden.

Andere factoren die van belang zijn bij de scheiding zijn: samenstelling van het eluens ([[pH]], toevoeging van hulpstoffen), kolomtype, doorstroomsnelheid (flow), lengte van de leidingen.

Wanneer de structuurformule van de te analyseren stof een [[asymmetrisch koolstofatoom]] bevat betekent dit meestal dat de stof aanwezig is in een mengsel van R en S [[Enantiomerie|enantiomeren]].

Dit mengsel is met een normale kolom niet te onderscheiden, omdat ze in gelijke mate binden aan de stationaire fase. De twee stoffen komen dan gelijkertijd van de kolom en geven maar één piek bij de detector. Dit kan wel met een chirale kolom waarin ook de stationaire fase uit enantiomeren bestaat. De scheiding wordt veroorzaakt door de reversibele bindingen van R (analiet) / R (stationaire fase en S (analiet) / S (stationaire fase) waarvan de stabiliteit iets verschilt. Het verschil in stabiliteit van de binding leidt ertoe dat er een scheiding plaatsvindt en dat er uiteindelijk twee pieken ontstaan.

 

== Detectiemethoden ==

De RI detector is een van de minst gevoelige LC detectoren. Dit komt doordat het zeer gevoelig is voor veranderingen in temperatuur, druk en flow rate. Als een gevolg hiervan, moet de temperatuur van de detector met uiterste precisie worden gereguleerd (tot het punt van 0,001◦C, evenals de temperatuur in de kolom. Ook is het niet mogelijk om een RI detector te gebruiken bij een HPLC met een [[Concentratiegradiënt|gradiënt]]. In het geval dat de mobiele fase niet isocratisch is zal de mobiele fase uit de kolom steeds meer afwijken van de pure mobiele fase. Hierdoor zal de refractie-index veranderen en de grafiek een piek weergeven, terwijl dit niet komt door een analyt. De RI detector wordt vaak gebruikt in combinatie met andere detectoren.

Ondanks deze nadelen wordt de RI detector vaak gebruikt. Dit komt doordat de detector ideaal is voor het detecteren van niet-ionische stoffen, die geen UV-straling absorberen en niet fluoresceren. Stoffen die het beste te detecteren zijn met de RI-detector zijn [[vetzuur|vetzuren]], [[alcohol (stofklasse)|alcoholen]], [[Koolhydraat|suikers]] etc.)

 

== Referenties ==